Cell：超11年追蹤揭示免疫壓力對癌癥轉移進化的作用
免疫評分（ImmunoScore, IS）：是一種將腫瘤微環(huán)境中的T細胞和細胞毒性T細胞的密度進行量化的標準檢測方法，對腫瘤的轉移及預后判斷具有重要的價值，目前已被證明可預測早期和晚期結直腸癌患者的臨床結果。
免疫編輯（Immunoediting）：2002年，免疫學家Schreiber和Dunn提出了著名的“腫瘤免疫編輯學說”，即免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長的同時腫瘤的惡性程度逐漸強化，在免疫系統(tǒng)和腫瘤的相互作用中，免疫系統(tǒng)發(fā)揮著雙重作用：在腫瘤發(fā)展過程中免疫系統(tǒng)會依次出現免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸三個階段，免疫系統(tǒng)既發(fā)揮抗腫瘤效應，同時又對其進行壓力選擇，使得腫瘤細胞發(fā)生免疫重塑而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment, TME）：是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的復雜環(huán)境，腫瘤微環(huán)境由細胞成分和非細胞成分組成。其中細胞成分包括腫瘤細胞本身、炎癥細胞、免疫細胞、間充質干細胞、內皮細胞以及與腫瘤相關的成纖維細胞等；非細胞成分主要包括細胞因子，趨化因子等。如今研究火熱的腫瘤免疫檢查點抑制劑針對的就是所處腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞，扭轉微環(huán)境中免疫抑制的現況，再度恢復機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊能力從而起到抗腫瘤效應。
免疫豁免（Immune-Privileged）：是指機體某些部位對外來抗原及自身抗原免疫反應很弱，以防止因免疫反應引起的組織損傷和功能紊亂。免疫豁免區(qū)即發(fā)生免疫排斥較弱的區(qū)域，包括眼球晶狀體，睪丸和中樞神經系統(tǒng)。這些區(qū)域可能因為長期缺乏抗原提呈細胞的刺激致使細胞表面缺乏特異性受體而無法與免疫細胞發(fā)生免疫應答或者只發(fā)生較弱的應答反應。
超長時間以及相對大量的切除樣本跟蹤分析腫瘤克隆進化，建立一個平行選擇模型解釋免疫編輯對癌癥轉移進化的作用。
免疫評分和免疫編輯可描繪不同的免疫逃逸機制
非復發(fā)性克隆是受免疫編輯的；進展中的克隆具有免疫豁免性
免疫編輯和免疫指數是復發(fā)轉移的兩個最佳預測因子
平行選擇模型描述了克隆免疫編輯和腫瘤進化
研究人員假設腫瘤細胞的轉移進展和克隆進化是由腫瘤內在特征以及外在免疫壓力介導的，遵循達爾文選擇的腫瘤克隆基礎，即在免疫清除期根除高免疫原性腫瘤克隆，而選擇具有低免疫原性和抗免疫攻擊性的腫瘤細胞變體進入平衡期。
據此，研究人員試圖對轉移性結直腸癌（CRC）患者進行為期11年的隨訪，研究免疫壓力如何影響轉移腫瘤的進化。
該研究描述了不斷演變的轉移基因組和免疫微環(huán)境，同時描述了免疫監(jiān)視、逃逸、克隆傳播與腫瘤進展之間的聯系。在此，研究人員提出了在轉移過程中腫瘤進化的平行選擇模型，其進展取決于局部免疫應答的強度和質量。
實驗選取2例IV期CRC患者的31例轉移灶作為縱向數據集，這2名患者存活時間極長。在疾病進展中，對2名患者P210和P45的轉移灶內與灶間不同的時間部位進行取樣（包括完全切除的原發(fā)腫瘤，同步及異時轉移灶），共36個樣本，并通過全外顯子組測序、免疫組化（IHC）淋巴譜系標記物定量來進行基因組和腫瘤微環(huán)境表征，用以評估轉移內、轉移間和患者間的基因組和免疫異質性。
圖1：兩名患者的取樣分布
圖2：IHC全片數字掃描和標記物復合熒光成像
實驗使用Parsimony Ratchet方法構建系譜樹?？傮w而言，與從解剖學上分離的轉移相比，來自相同轉移位置的樣本在系統(tǒng)發(fā)育上更接近并且共享更多突變。
圖3：基于原發(fā)和轉移樣本一致突變的系譜樹
接下來根據編碼突變譜的相似性推斷出每個轉移的起源，父子關系由最高的Jaccard相似系數定義。然后，從診斷時間到最后一次隨訪，用轉移灶進化系譜樹顯示轉移性傳播的途徑，每個樣本用圓圈表示，圓圈大小表示腫瘤尺寸大小，外圈顏色為切除位點，內圈顏色表示免疫指數（HS和WS）。在患者P210中，腫瘤部位M10-b3是大體積轉移M10的組成部分，但其起源不同于從相同轉移（M10-b1/-b2/-b4）取樣的其余區(qū)域，表明M10是多步定植的結果。值得注意的是，在兩名患者中，只有一例同一時期轉移擴大為轉移譜系：P210中的M6和P45中的M3，表明一些轉移灶比其他轉移灶更具攻擊性。
圖4：轉移灶傳播樹形圖
盡管有線性進化模型的跡象，但存在平行進化的要素，例如原發(fā)和轉移性腫瘤之間的高水平遺傳分化。此外，在轉移M6中觀察到TP53的平行進化，其中在兩個不同的克隆中檢測到兩個突變的基因座（患者P210的持續(xù)型克隆1和消除型克隆12）。同時，實驗觀察到在幾個轉移瘤中，獨特的腫瘤克隆正在進行進化。 此外，患者P210在空間異質性M10樣品中存在不同的腫瘤克隆現象，這也證明了轉移灶內克隆的異質性。
基因組印記變化方面，通過將測序覆蓋度、拷貝數變異和腫瘤純度整合來估計給定體細胞突變的細胞流行率，可計算得到12種不同的腫瘤克隆。其中，沒有檢測到原發(fā)病灶的主克隆，可能的原因是原發(fā)腫瘤的取樣有限，然而疾病進展期間最持久的克隆可追溯到原發(fā)性腫瘤。
圖5：腫瘤克隆進化圖
對于這兩位患者而言，在隨訪時間線上某一點發(fā)展的12種不同的腫瘤克隆超過克隆檢測閾值10％，具有相似克隆突變的轉移灶在解剖學上，時間上和系統(tǒng)發(fā)育上密切相關。
圖6：腫瘤克隆超過檢測閾值的10%
為了闡明免疫背景，實驗通過單重IHC，多光譜成像和多重免疫基因表達來檢測腫瘤浸潤淋巴細胞?？傮w而言，P210和P45轉移灶的表型差異較大。
圖7：免疫細胞密度柱狀圖
單獨對每個轉移灶進行免疫編輯評分，把觀察到的每個非同義突變作為預估的免疫原性突變比率，通過繪制免疫編輯評分(Yes/No)及相應的免疫評分值(Hi/Lo)定義四類轉移瘤：HiYes、HiNo、LoYes和LoNo。高于預估的免疫原性突變率表明缺乏免疫編輯和免疫耐受（得分>0.8，n=24）。
圖8：免疫編輯評分與免疫原性突變率
然而，54%具有高免疫評分的轉移瘤是進行過免疫編輯的。這一結果表明，免疫浸潤是免疫編輯發(fā)生的必要不充分條件，并且免疫編輯發(fā)生在轉移期。此外，免疫編輯與各類T細胞表型（如細胞毒性，粘附，Th1，Tfh，CD8細胞，趨化因子CCL2，細胞因子和免疫檢查點等）均具有很強的相關性。
在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）存在下鑒定無免疫編輯的一組轉移灶揭示了腫瘤-外在逃逸的幾種機制。在HiNo組（免疫編輯評分>0.8，免疫評分>60），CT和IM顯示了FOXP3+細胞和PD-L1+細胞的密度增加，通過測量不同克隆型的數量來判斷較高的TCR-a多樣性，表明該組中T細胞克隆擴增的缺失或不足。
圖9：免疫評分和免疫編輯揭示了不同的逃逸機制
因此，免疫編輯的轉移灶具有高免疫評分和T細胞與增殖的腫瘤細胞之間短距的特點，而非免疫編輯轉移灶的FOXP3+T細胞密度增加，PD-L1表達增加，以及T細胞與PD-L1+細胞顯著接近。
為了解腫瘤復發(fā)風險的特征，根據腫瘤克隆是否已經產生子代轉移將腫瘤克隆分為三組（持續(xù)型，消除型和早期非復發(fā)型）。
實驗通過幾種基因組特征（包括Dn/Ds評分）比較了持續(xù)型和消除型腫瘤克隆，并且計算了腫瘤克隆的免疫編輯評分。值得注意的是，免疫編輯在消除型腫瘤克隆中更為常見，而免疫編輯的缺失在持續(xù)型克隆中較為普遍（只有一個來自P45克隆2的持久型克隆具有免疫編輯，而這個克隆只有一個位于ZDHHC11基因內的免疫原性突變，其表達水平可以忽略不計）。
圖10：免疫編輯區(qū)分三型腫瘤克隆
實驗結果顯示，使用免疫選擇來區(qū)分持續(xù)型和消除型克隆優(yōu)于Dn/Ds評分；來自相同轉移的不同克隆具有不同的免疫編輯評分，免疫編輯是腫瘤克隆復發(fā)較為理想的預測因子（AUC = 0.89），并且若除去P45克隆2的影響因素，則更佳（AUC = 0.98）。在具有異時轉移的卵巢癌病例中觀察到類似的結果。
最后，研究人員檢驗了具有臨床相關性的參數，對包括臨床、基因組、免疫和空間等22個參數進行單元變量分析。免疫編輯和免疫指數是轉移復發(fā)的兩個有效的最佳預測因子。研究顯示，較低的免疫指數，免疫編輯的缺失和較高的轉移負荷對無復發(fā)存活率具有不利影響。
圖11：免疫編輯（左）和免疫評分（右）的單變量無復發(fā)生存曲線
通過將免疫編輯和免疫指數疊加在轉移灶傳播樹形圖上來評估免疫系統(tǒng)與腫瘤隨時間傳播之間的關系。這說明了轉移灶的局部控制（較小的尺寸）和免疫指數在預防復發(fā)中起到保護作用。因此，轉移進展和復發(fā)時間取決于機制相關的免疫參數。
圖12：疊加免疫編輯和免疫指數的轉移灶傳播樹形圖
該實驗通過對特長生存期（超過11年）以及相對大量的切除樣本的追蹤研究，揭示了免疫系統(tǒng)在轉移復發(fā)過程中所起到的作用：
（1）每個轉移灶本身就是一種疾病，時間及空間異質性的轉移灶，甚至是同一轉移灶內都存在不同的臨床反應、基因組結構和免疫活性，因此轉移灶不能平均化處理。 （2）實驗通過平行選擇模型描述了轉移進化圖譜，用以追蹤腫瘤的多種傳播途徑。然而，當僅考慮基因組學特征時，腫瘤克隆是否易于傳播不能很好的得到解釋。 （3）實驗在時間和空間維度分析了與腫瘤克隆相關的免疫微環(huán)境，證實了非復發(fā)性克隆是受免疫編輯的，持續(xù)型和進展的腫瘤克隆具有免疫豁免性。這一發(fā)現首次揭示了克隆傳播和免疫監(jiān)視之間的關系，對治療有重要意義。靶向克隆新抗原可以通過靶向保留免疫原性突變的、持久的、未經編輯的腫瘤克隆來預防復發(fā)。 （4）實驗雖然可以在疾病時間表中檢測到有效的免疫激活和高免疫，但隨著時間的推移，免疫編輯的總體下降趨勢意味著腫瘤獲得免疫逃逸。越來越多的證據表明，在獲得大量突變之前，染色體不穩(wěn)定性可能是轉移的早期驅動，患者P45由此可見，這可能導致新抗原的濃度稀釋和自身肽對抗原呈遞的競爭優(yōu)勢。在這種情況下，監(jiān)視的免疫細胞募集將被沉默，免疫編輯也將無法檢測。此外，研究人員發(fā)現未經編輯的高免疫浸潤轉移灶也具有高倍性，分析可能的原因是腫瘤細胞已經充滿新抗原，染色體不穩(wěn)定性在此之后。在產生足夠強的新抗原信號后，免疫細胞可被募集，但受到免疫抑制的影響，導致無法檢測到免疫編輯。實際上，在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）存在下缺乏免疫編輯揭示了幾種逃避機制，包括增加免疫抑制細胞的密度和從腫瘤細胞中分離免疫細胞。 （5）免疫指數、轉移灶大小以及缺乏編輯是復發(fā)的獨立預后因素。實驗構建的轉移性癌癥進展的預測模型，可以正確預測兩名患者的復發(fā)風險，也成功在另外獨立集上得到驗證。 上述研究可為了解癌癥傳播和免疫治療的發(fā)展提供有效依據。 參考文獻：